1970年Ryan正式报道了欧洲千里光Senecio vulgaris对均三氮苯类除草剂西玛津(simazine)和莠去津(atrazine)产生抗性，此后杂草的抗药性逐渐成为除草剂研究领域的一个热点。1985年，Comai等将鼠伤寒沙门氏杆菌Salmonella的抗草甘膦突变基因(aroA)转移到烟草上首次获得了抗草甘膦的转基因作物。1996年，抗草甘膦转基因大豆(genetically engineered soybean，GE)由美国孟山都(Monsanto)公司开发并正式投入商业生产，由此拉开了抗除草剂转基因作物培育的序幕。此后，抗除草剂作物的研发及推广突飞猛进，农业生物技术应用国际服务组织(Intemational Serice for the Acquisition of Agri-biotech Applications，简称ISAAA)的数据表明，2009年全球转基因作物的种植面积达到1.34亿hm2，其中，仅耐除草剂作物的种植面积就高达6920万hm2，占总面积的52%。在转基因作物带来巨大的商业利益和社会效益的同时，抗性基因的流向和由此引发的食品安全性问题始终存在着巨大的争议，甚至在一定程度上阻碍了转基因技术的发展。在抗除草剂转基因作物，特别是抗草甘膦作物的推广中，以英国和德国为代表的大多数欧盟成员国以及日本、韩国、新西兰等持反对态度，德国2008年末已停止了对转基因作物的种植。欧共体规定，转基因油菜及其它转基因作物食品不能进入欧共体各国，但通过花粉诱变、离体选择育成的抗除草剂作物则可进入。常规育种手段不能像转基因技术一样将物种之间的基因资源利用的十分充分，但却以其自身没有外源基因转入而更容易被接受和推广。
目前，通过非转基因手段培育的抗除草剂作物涉及玉米、大豆、菜豆、烟草等20余种。所抗除草剂包括咪唑啉酮类、磺酰脲类、环己烯酮类、有机磷类、均三氮苯类和激素类等6大类，其中，最为突出的是抗咪唑啉酮类除草剂的Cleafield系列作物。因此，在转基因作物的安全性尚未得到证实之前，利用非转基因技术选育抗除草剂作物更具有发展前景。
1 抗除草剂作物的研究现状
目前通过非转基因手段培育的抗除草剂作物主要是抗咪唑啉酮类作物，其中，已经商品化的有玉米、油菜、小麦、水稻和向日葵等。
抗咪唑啉酮类玉米研究始于1982年，Newhouse等最先通过诱变获得了XAl7、X112、QJ22、XS40、ZA54、UVl8、ACl7和QTl5等8个抗性细胞系，从以上细胞系中选择XAl7、X112和QJ22等3株经过逐代筛选纯化培育成了抗性品种，并成功商品化。
1992年，“Smart”油菜成功商品化，成为继玉米之后的第二种抗咪唑啉酮作物。抗性油菜能够成功研制并且商品化的原因之一是眯唑啉酮除草剂杀草谱广，特别是能有效防治与油莱亲缘关系相近的十字花科杂草。
水稻品种AS3510经过诱变之后，对M2代加以除草剂咪唑乙烟酸的选择压，成功获得了可以将抗性遗传给后代的品系93AS3510，经过不断筛选，从中开发了两个品种CLl
2 非转基因抗除草剂作物的主要培育方法
2.1 除草剂自然选择与杂交法
在抗除草剂作物的培育中，鉴定并获得具有天然耐药性的植物是研究的关键，也是进行其它生物技术以及遗传工程修饰的前提。不同作物品种或同种作物不同品系之间对除草剂的抗性水平具有很大的差异，自然选择的方法是利用这种差异进行天然耐药性植株的筛选。苏少泉研究表明，植物群体中存在天然的抗性基因，通过除草剂的不断选择，观察植物在除草剂致死剂量下的反应，叫以筛选出抗除草剂的作物。
在自然界中，一些植物的遗传是母系遗传(细胞质遗传)，难以将外源基因导入叶绿体获得表达，而传统的杂交手段正好弥补了这一缺陷。在抗除草剂作物的培育过程中，将自然筛选获得的抗性作物与优良栽培品系进行杂交，组合两个或多个亲本的优良性状于杂种中，并经过基因的分离和重组，产生各种性状的变异类型，从中选择出所需要的抗性性状，进而培育出对人类有利的优良杂交品种。自然选择和杂交法培育抗性作物的方法工作量大，但较_好地利用了植物中的天然耐性基因以及杂种优势，现在仍被许多研究者使用。
陶渡等自1992年开始进行抗除草剂基因筛选及其利用的研究，利用田间试验及生化分析的方法对多种作物进行了抗除草剂作物的筛选。其中，在对66份菜豆品种和品系进行抗草甘膦基因筛选过程中明确了不同菜豆品种对草甘膦抗性存在差异，并对其抗性机制进行了深入的研究，成功筛选出89-09、89-53两个高抗品种。李萍等比较了34个谷子品种对除草剂扑草净(prometryn)和丙炔氟草胺(flumioxazin，商品名：速收)的耐药性差异，明确了除草剂压力下各种生理生化指标的变化。
Tan等通过杂交育种手段最先获得了抗三氮苯类除草剂的甘蓝型油菜品种OAC triton。Ayotte等报道，通过与天然的阿特拉津耐药性芜菁突变体进行杂交，可将阿特拉津的耐药性导入花茎甘蓝及花椰菜等作物。Wang＆Darmency利用谷子抗除草剂新种质资源3840与优良亲本材料214等杂交，借助除草剂的选择压力对后代进行鉴定，然后用214作为轮回亲本与F1及其回交后代连续回交，获得了抗性基因表达完全、遗传稳定、农艺性达到实用水平的谷子新种质坝谷214，并通过国家品种审定。
2.2 化学诱变法
Neuffer等曾发现甲磺酸乙酯(EMS)-石蜡油处理玉米花粉可以导致基因突变，并且诱变效果远高于电离辐射等物理方法。目前公认的最有效的化学诱变方法是EMS-石蜡油诱变花粉技术，以EMS为诱变剂，以石蜡油为载体剂，将不同浓度的EMS溶液分别处理目标作物未受污染的花粉，再将被处理的花粉与花丝结合，并对其后代进行相应的除草剂处理，筛选出抗性植株并逐代纯化，育成抗除草剂作物新品种。
1986年ICl种子公司(美国)采用此方法处理玉米自交系的成熟花粉并以相应的除草剂进行筛选，最终获得了抗除草剂普杀特(pursuit)突变体，其中抗性最强的植株可以忍受10倍除草剂致死剂量，1991年该公司成功推出了抗除草剂杂交种并取得巨大的经济利益和社会反响。李海军等用不同浓度的EMS处理玉米自交系成熟花粉，通过对诱变后代的田间筛选，从多个自交系后代中选出了2个具实用价值的突变体。
相比于花粉诱变，种子诱变的技术难度较低，操作的可行性更强。直接把种子浸泡在含有化学药剂的溶液中，即可诱发各类体细胞突变。经诱变处理的种子所长成的植株称为诱变第1代(简称M1，依次类推，后代为M2、M3等)，M1代中，嵌合体、隐性突变多且主要为非遗传的生理伤害变异，一般不进行除草剂的筛选。M2代中，突变细胞参与生殖细胞的形成，抗性遗传性状会出现分离，施以除草剂进行选择可以获得抗性突变体，以此突变体为选育材料逐代纯化则可以获得抗性品种。
Newhouse等和Pozniak等以小麦品种Fidel为亲本，叠氮化钠为诱变剂，采用系谱法进行逐代选择，从1.2万株M2中获得了4个抗性品系FS1、FS2、FS3和FS4，将其作为选育抗性材料作进一步培育，成功获得了抗咪唑啉酮类除草剂的小麦。叶俊等用7射线和EMS处理水稻种子，经过筛选和鉴定初步构建了水稻种子突变体库。姜振峰等以叠氮化钠为诱变剂，处理黑农37、东农42、东农92-070和东农44等大豆品种，处理后的植株成活率降低，有矮化、晚熟和抗除草剂特性增强的现象。
化学诱变的部位并不仅仅局限于花粉和种子，几乎所有植物器官和外殖体都可进行诱变，但是一般认为细胞水平的诱变具有更广阔的应用前景，尤其是诱变胚性悬浮细胞，有可能获得同质突变体。
小孢子是体细胞克隆变异水平较小的单倍体群体，容易通过诱变选择抗性性状。1996年注册登记的抗咪唑啉酮类除草剂的油菜就是以亚硝基脲乙酯为诱变剂进行小孢子处理，在咪草烟的环境中进行不断的选择而获得的。此外，董颖苹等用EMS对“中薯二号”四倍体栽培种茎段组织进行化学诱变，结果表明，EMS能够有效渗入生长点细胞，使再生植株和组织器官发生变异，故可以应用于马铃薯抗性、高产等方向的诱变育种。刘艳萌等用EMS对草莓叶片进行处理后，诱变后代对盐渍环境表现出一定的抗性。
目前化学诱变中的诱变剂多为碱基类似物、硫酸二乙酯(DFS)、叠氮化钠(NaN3)、EMS等。EMS主要诱发点突变，与其它诱变剂相比，其诱变后产生的显性突变体相对较多，因而易于进行突变体筛选，是化学诱变育种中应用最广泛的一种诱变剂。当然，射线(紫外线、X光线、Y射线，中子线)、激光微束、离子束、微波、超声波、热力等物理诱变手段也在使用，但成本往往较高，且一般实验室不具备放射源，此外，物理诱变常导致一些有害变异。Christianson用X射线诱变烟草植株，然后用光合作用抑制剂施以选择压，从中选出存活的绿色组织进行培养，虽然获得了抗性植株，但再生植株却表现了明显的畸变。
2.3 植物组织培养法
植物组织培养也叫离体培养，是现代生物技术中发展较快且较为成熟的一项技术。在抗除草剂作物的培育过程中，将离体的植物器官或组织在添加一系列不同浓度除草剂的培养基中进行人工培养，诱发其产生愈伤组织。由于愈伤组织细胞容易受除草剂的影响而产生突变，从中可以筛选出抗性突变体，进而培养出再生植株，育成新品种。
苏少泉和Tan等研究表明，作用靶标单一的除草剂品种易通过细胞与组织培养的方法获得抗性细胞系并培养出抗性植株，因此，ALS抑制剂类除草剂(磺酰脲类、磺酰胺类、咪唑啉酮类等)一直是植物组织培养中的研究热点。Caretto等在胡萝卜细胞培养过程中，施以不同浓度的绿磺隆，成功选出了抗性细胞系。丁君等和刘伟等通过组织培养的手段在烟草中成功诱导出对苯磺隆具有抗性的愈伤组织，并且证实抗药性能在整株水平上表达。Shaner在组织培养中，逐步加大草甘膦的用量，分阶段选择后获得了碧冬茄MP4-G，经检测，MP4-G细胞中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，简称EPSPS)过量产生达15～20倍，对草甘膦的耐性显著提高。
自然选择、杂交育种、诱变育种、组织培养等非转基因育种方法如果单一应用，往往存在耗时长、工作量大等缺点，在实际操作过程中应注重它们之间的联系。先通过自然选择或化学诱变方法获得抗性植株或组织，然后通过组织培养或传统的杂交育种等方法进行培养，最后施以不同浓度的目的除草剂进行鉴定筛选。
3 研究对策与展望
无论是通过转基因技术还是非转基因技术，抗性作物的成功培育都是除草剂研究和应用领域的重大突破，在扩大除草剂的使用范围、延长使用时间、降低除草费用、减少耕作、降低能耗等方面都起到了重要作用。
应用非转基因技术进行抗除草剂作物的选育应该加强以下几个方面。(1)加强植物抗除草剂作用机制的研究：一是注重研究抗性和敏感植物之间因抗性变化导致的结构、组织的差异；二是探究抗除草剂作物各种酶系(靶标酶、解毒代谢酶、保护酶系等)的变化以及各酶之间的关联；三是进行抗性基因的发掘与克隆。(2)进行天然野生资源抗除草剂特性的筛选和利用：首先，利用除草剂的选择作用，对野生资源进行抗除草剂特性的筛选，找到稳定遗传的抗性群体；其次，利用传统的育种手段，将具有抗性的野生品种与栽培品种进行杂交、筛选、回交等，获得具有抗性的杂交种；最后，对获得抗除草剂性状的品系进行抗性和遗传稳定性等的鉴定和培育，使其成为可以推广的栽培品种。(3)加强对农作物的诱变抗性筛选：根据不同的作物、不同的组织和部位确定诱变所需的剂量；诱变材料的选取应该以性状优良的栽培品种为主，使其在获得抗除草剂特性的同时，还保持其原有的诸多性状。(4)优化组织培养条件，完善组织培养方法：通过多次继代培养，不断转移外围的已经产生抗性的组织，避免不同部位细胞接触除草剂的量不同而产生“假抗性细胞”；将细胞培养和愈伤组织、花粉、小孢子等的诱变结合起来，先获得抗性体系，再进行组织培养。(5)重视抗性后代遗传稳定性的研究和突变体的早期鉴定、筛选：除传统的形态学、细胞学方法和生理生化指标的测定方法外，利用RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机增多态性DNA)、SSR(简单重复分子标记)和AFLP(扩增片段长度多态性)等技术对诱变获得的控制除草剂抗性的基因进行早期定位，构建突变体基因库。
未来在通过非转基因手段培育抗除草剂作物的发展道路上，分子标记辅助选择技术也将以其准确、有效的特点，在选择群体范围、缩短育种时间方面提供更有力的技术支持。
作者单位：(东北农业大学农学院，哈尔滨 150030)
注明：农业部转基因生物新品种重大专项（2008ZX0
