植物遗传转化中，为了从大量非转化细胞中选择获得转化体，筛选标记基因起着非常重要的作用。目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因。随着转基因植物的日益增多和商品化，筛选标记基因潜在的生态和食用安全性也日益引起人们的关注。筛选标记基因也成为转基因植物环境释放或商品化生产的制约因素。
很多研究方法都被用来从转基因植物中去除选择标记基因，常用的有共转化系统(Komari et al.，1996)、转座子系统(Goldbrough et al.，1993、同源重组系统和位点特异性重组系统(Zubko et al.，2000；Hoa et al.，2002)。共转化系统要求较高的转化频率，同时共转化的目的DNA和选择标记基因在转化细胞中要处于不连锁的状态，这两个条件使得共转化系统的应用受到了限制（Ebinuma et al.，2001)。在转座子系统中，被修饰的转座子在被切除后往往会重新插入到基因组中的其他位置，引起其他基因的插入突变(张余洋等，2004)。同源重组系统和位点特异性重组系统是借助重组作用使选择标记基因缺失，从而达到将它去除的目的。然而，在植物中，同源重组发生的频率很低，所以其应用受到限制(Hohn et al.，2001)。位点特异性重组系统由于其精确性和较高的重组频率，在无标记转化方面的应用越来越受到重视(Kilby et al.，1993；Sauer，1994)。
1 位点特异性重组类型
位点特异性重组是指在重组酶介导下，在特异的重组位点间发生重组，导致重组位点间交互交换的一种精确重组形式。能够在植物中发生重组反应的，目前应用较多的主要有三类：Cre/loxP、FLP/FRT、和R/Rs，其中Cre/loxP系统研究最广泛、也最深入。
1.1 Cre/lox重组系统
Cre/loxP重组系统来源于大肠杆菌噬菌体Pl，系统由重组酶Cre及其识别位点loxP组成(Sauer and Henderson，1988)。Cre重组酶来自噬菌体P1基因编码的一个相对分子质量为38 500的蛋白，是位点特异性重组酶中最重要且应用最广泛的一种重组酶，也是位点特异性重组系统的关键因子，其活性的大小直接影响着重组效率的高低。Cre酶识别的loxP序列基本结构长为34bp，中间是8bp的核心序列，两边是13bp的反向重复序列。不需其他蛋白质等辅助因子和额外能量的参与便可在体内外对线性、环状甚至超螺旋的DNA分子进行重组反应。当Cre重组酶识别loxP位点后，可以在该位置切断DNA，并在断端形成中间体，此后在Cre重组酶催化下可重组连接。因此，同一条DNA分子上若有两个loxP位点，如果顺序相同，重组后则可能出现loxP位点间核酸序列被特异性删除，仅留下一个loxP位点，这是Cre/loxP系统最广泛的应用方式(Odell et a1.，1994：OW，1996)。
1.2 FLP/FRT系统
FLP/FRT系统来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞核内2μm质粒(Broach et al.，1982)。FLP是2μm质粒编码的特异性重组酶，其识别序列FRT结构与loxP相似，为一段34bP的DNA序列，所不同的是野生型的FRT基因在34bP的DNA序列侧翼还有一段13bp的反向重复序列，该序列可以增强FLP介导的重组反应，在体外它可以影响重组过程中的切口形成和链交换(Jayaram，1985)。该重组系统被证明在多种动植物中都有效(Lyznik et al.，1993；Lloyd and Davis，1994；Luo et al.，2000)。
1.3 R/Rs系统
R/Rs系统来源于接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的SRl质粒(Araki et al.，1985)，包括重组酶R和2个重组酶识别位点Rs。Rs是一段31bp的DNA序列，由2个12bp的反向重复序列和1个7bp的不对称间隔序列组成。在重组酶R的作用下，特异位点Rs发生同源重组，可切除2个Rs位点间的核酸序列，也可被用于标记基因的剔除(Sugita et al.，2000)。
除了以上三种常用的重组酶外，许多的重组酶也陆续被证实可用于植物位点特异性重组，比如来自于噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser and Kahmann，1991)、来源于酿脓链球菌的广寄主范围的质粒pSM-19035的β/six重组系统(Gronlund et al.，2007)、来自于链霉菌属噬菌体的phiC31整合酶(Rubtsova et al.，2008)、来自于细菌质粒RK2和RP4的ParA/MRS系统(Thomson et al.，2009)。
2 位点特异性重组在剔除选择标记基因中的应用
2.1 利用二次转化或杂交的方式剔除选择标记基因
Dale和OW (1991)年首次利用Cre/loxP位点特异性重组系统在转基因烟草成功地剔除了选择标记基因。该研究在选择标记基因潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase，hpt)基因的两侧加上同向的loxP序列，转化荧光素酶基因，分别通过二次转化和有性杂交将Cre酶基因导入到已整合有hpt基因和荧光素酶基因的转基因植株内，成功地剔除了hpt基因，删除效率达90.9%。Russell等(1992)在编码磺酰脲(sulfonylurea)抗性的选择标记基因乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase，als)基因两侧加上两个同向的loxP序列转化烟草，分别通过二次转化和与含有Cre酶的转基因烟草杂交，在转基因植株后代中可发现磺酰脲抗性阴性、报告基因β-葡萄糖苷酸酶(β-gIucuronidase，gus)阳性的转基因植株。Southern杂交结果证实标记基因als已被Cre酶删除。Onouchi等(1995)用含R重组酶基因的转化植株与含有标记基因位于Rs位点间的植株进行杂交，获得了无标记基因的拟南芥转基因植株。单晓映等(2006)通过多步骤重组，建立了可在植物中广泛应用的FLP/FRT位点特异性重组系统。该系统利用两侧含有FRT位点的als基因作选择标记转化烟草，随后利用二次转化的方法将含有由热诱导启动子nsp启动的FLP重组酶基因转入转化植株，热激处理后，热诱导型启动子hsp调控的重组酶FLP基因的表达使得位于选择标记基因als两侧的FRT位点间发生重组反应，41%的经热激处理的二次转化植株选择标记基因als被有效地删除。Gidoni等(
借助重组酶基因的二次转化或与含重组酶基因的转基因植株杂交引入重组酶来完成标记基因的删除，不仅需要通过自交分离进一步去掉重组酶基因以及转化重组酶基因时带入的另一个选择标记基因，使得无选择标记基因转基因后代选育周期过长，而且二次转化对于转基因困难的作物来说应用有限，有性杂交方法也不适合无性繁殖作物。
2.2 通过重组酶的瞬时表达来剔除
利用重组酶的瞬时表达来完成重组可以解决上述问题。农杆菌介导的T-DNA转移时，可以通过未整合的T-DNA分子瞬时表达外源基因，因而可以用来实现对重组酶的瞬时表达。Gleave等(1999)用含有Cre表达载体的农杆菌侵染含有loxP元件的转基因烟草，无选择压下获得再生芽，其中不到3%的再生芽发生了loxP之间的重组，且并未发生Cre基因的整合。Kopertekh等(2004)借助带Cre酶基因病毒载体，通过病毒侵染后瞬时表达Cre酶，成功的剔除了标记基因两侧含有loxP位点的转基因植株中的标记基因。Jia等(2006)利用烟草花叶病毒载体瞬时表达Cre酶成功剔除了转基因烟草中的选择标记基因。这种去除标记的优势在于不需要重组酶基因的整合形式，省略了分离步骤，但是频率低，也需要二次转化，限制了实际应用。
2.3 利用诱导型启动子剔除标记基因
研究发现，Cre重组酶基因在植物中一直高水平表达，导致植物形态和产量改变(Padidaln，2003)。鉴于此，一些研究者采取了构建诱导型表达载体的策略，通过一次转化来剔除标记基因。在诱导型表达载体中，重组酶Cre的表达受控于化学诱导或热诱导激活型启动子，在适当的时候对转基因植物给予化学诱导剂处理或热激处理来删除标记基因。Zuo等(2001)利用Cre/loxp系统建立了一个化学诱导的拟南芥位点特异性删除体系。该体系中Cre重组酶基因表达受控于以雌激素受体为基础的融合转录激活因子XVE，选择标记基因、Cre酶基因和XVE序列位于两个同向的loxP位点间，以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，gfP)基因为报告基因，经雌二醇处理的转基因植株，两个loxp位点间的选择标记基因、Cre酶基因和XVE均被有效删除，下游gfp基因在启动子的作用下表达。该系统剔除标记基因可控性好，诱导删除效率高。Yuan等(2004)将选择标记基因和Cre酶基因置于两个loxp位点之间，Cre酶基因受控于氯乙酰替苯胺诱导性启动子（chloroacetanilide-induced promoter，In5-2)，通过诱导删除获得了无选择标记基因烟草。Ma等(2008)利用水杨酸诱导的Cre/loxP删除系统获得了无标记的转芪合酶基因马铃薯。Woo等(2009)利用胁迫诱导的过氧化物酶基因启动子驱动的重组酶FLP系统转化烟草，在附加有过氧化氢的培养基中，13%～41%的再生植株都成功地删除FLP和hpt基因。
Liu等(2005)利用热诱导启动子HSP81-1启动Cre酶基因的表达，获得了无选择标记基因的烟草。Deng等(2009)将热激诱导启动子HSPl8.2驱动的重组酶FLP和35S启动子驱动的转录因子(BABYBOOM，BBM)置于两个同向的FRT位点间转化中国毛白杨，BBM的过量表达使得毛白杨的体细胞胚能够再生出表型变异的转基因植株，热激处理后BBM被删除，植株表型恢复正常。利用该系统可以不使用任何选择剂来利用体细胞胚再生无标记转基因植株。利用热激蛋白启动子启动Cre酶基因的表达，分别在拟南芥(Horff et al.，2001)、玉米(Zhanget al.，2003)、烟草(Wang et al.，2005)、马铃薯(Cuellar et al.,2006)和西红柿(Zhang et al.，2006)等作物中都成功地删除了标记基因。
Sugita等(2000)利用R/Rs位点特异性重组系统建立了GST-MAT载体系统。该载体系统含有来源于农杆菌的异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase，ipt)基因和一个可移除DNA元件，ipt基因作为选择标记基因，其编码细胞分裂素生物合成途径中的第一个酶。ipt过量表达可使转化芽在无激素的培养基上形态发生异常。GST-MAT载体中R酶基因和ipt基因位于两个同向的Rs序列间，R重组酶基因由来自于玉米谷胱甘肽硫转移酶(glutathione-S-transferase，GST-Ⅱ-27)的化学诱导型启动子控制，该启动子可受除草剂解毒剂“Safener”的诱导。转化后在ipt基因作用下形成变态芽，转移至含“safener”的培养基后，诱导GST-Ⅱ-27启动子表达R重组酶基因，使ipt基因和R酶基因同时被删除，变态芽恢复正常，并进一步再生植株。42个分化的不定芽中有37个为变态芽(88%)，“Safener”诱导删除后得到5个(14%)仅含有报告基因gusA的转基因植株，Southen杂交表明，86%无选择标记转基因植株含有单拷贝GUS基因。Saelim等(2009)利用该系统对木薯进行转化，表型正常的转化植株中有88%～96%为无标记转基因植株。Thirukkumaran等(2009)利用该系统对长寿花进行了成功转化。
在诱导删除系统中，可以通过化学或热诱导有控制地表达重组酶基因，使其在转基因植物的T0代就可以表达，高效地切除选择标记基因和重组酶本身，这就简化了操作程序；同时可控制重组酶基因表达至一定水平，缩短了表达时间，避免了重组酶基因过量表达对植物造成的伤害；同时诱导删除方式也适合于无性繁殖作物，有很大的应用前景。
2.4 利用组织特异性启动子删除标记基因
也可借助于组织特异性启动子调控表达重组酶基因来删除标记基因。Mlynarova等(2006)利用小孢子特异性启动子在烟草花粉中成功实现了筛选标记基因的删除。生殖细胞特异性标记基因删除系统也被有效地用于拟南芥(Verweire et al.，2007)。Li等(2007)利用胚芽特异性启动子实现了在大豆胚芽中定位删除选择标记基因hpt。Kopertekh等(2009)利用种子特异性启动子驱动的Cre酶系统进行甘蓝型油菜的转化，成功的实现了Cre酶基因和标记基因的剔除。该系统不需要任何诱导剂即可完成标记基因的组织特异性删除。
3 不同的重组系统间的协同作用
转化中除了使用不同重组系统外，利用Cre/loxP系统与FLP/FRT系统的协同作用，构建杂合位点，也可用来剔除筛选标记基因。罗克明等(2005)利用Cre/loxP系统与FLP/FRT系统的协同作用，构建了新的位点特异性重组酶系统，重组酶基因FLP在热激蛋白启动子控制下，在烟草中删除效率达48.2%～84.9%。Luo等(2007)在同向的两个特异性识别位点loxP与FRT间加入4 bp的间隔序列融合构成一个新的杂合识别位点loxP-FRT。利用其对烟草的转化结果表明，重组酶Cre或FLP单独表达时可提高位点特异性重组酶系统在转基因植物中对外源基因的删除效率，大多数转基因中删除效率可达到100%。
4 应用前景与展望
随着作物基因组研究的发展，大量有价值的目的基因被克隆，使得作物遗传改良从某种程度上由原来的受基因来源限制变为受基因转化技术的限制。随着越来越多的转基因植物进人环境释放或商品化种植，其生物安全性问题也日显重要。转基因植物中选择标记基因的剔除，不但可以省去费时、费力的选择标记基因的安全性评价过程，而且也从根本上解决了选择标记基因的生物和环境安全性问题。位点特异性重组为无标记转基因植物的获得提供了一个重要的手段，利用该技术在剔除选择标记基因的同时可提高单拷贝插入频率，增加了目的基因的稳定表达(Srivastava et al.，1999；Kumar and Thompson，2009)，该技术与微染色体技术结合还可实现多基因的转化(Ow，2007)。利用可诱导的自切除途径可简化操作步骤，不需要遗传分离，适用于有性和无性繁殖的作物（或植物)，一步即可获得目的植株，在烟草、拟南芥等双子叶模式植物中得到了广泛的应用。目前，位点特异性重组已成功应用于单子叶植物如牧草剪股颖(Hu et al.，2006)、玉米(Zhang et al.，2003；Vega et al.，2008)、水稻(Hoa et al.，2002；Srivastava and Ow,2002；Hu et al.，2008)和小麦(Srivastava et al.，1999；Rubtsova et al.,2008)。
我国作为一个农业大国，开发自己的安全转基因作物，对未来的粮食安全生产有着重要的意义。借助诱导性位点特异性重组剔除筛选标记基因，在无选择标记基因工程方面无疑有着巨大应用潜力。
作者单位：（西北农林科技大学生命科学学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨陵，712100）
注明：本研究由教育部转基因研究与产业化开发专项（JY03-A-13-01）、转基因专项重大课题（2008ZX08002）子课题和西北农林科技大学博士科研启动经费（Z111020913）共同资助。
